6月10日，艾偉拓邀請(qǐng)到多位業(yè)內(nèi)專家，圍繞“核酸脂質(zhì)遞送系統(tǒng)穩(wěn)定性"這一主題，從核酸/脂質(zhì)遞送系統(tǒng)穩(wěn)定性困境與潛在對(duì)策、mRNA關(guān)鍵質(zhì)量屬性、脂質(zhì)體及LNP凍干工藝開發(fā)、脂質(zhì)遞送系統(tǒng)中保護(hù)劑應(yīng)用等不同方面展開介紹與討論。

各位專家分享的干貨得到了觀眾的積極反饋，提出了很多有深度的問題。艾偉拓產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)對(duì)問題及答復(fù)進(jìn)行了收集整理，以供各位醫(yī)藥制劑行業(yè)的朋友參考。如果您有其他疑問或想法希望進(jìn)一步討論，歡迎加入我們的專業(yè)討論群，加群方式詳見本文末尾。

此外，對(duì)于未能參與本次線上論壇的朋友也請(qǐng)不用著急，艾偉拓已與多位業(yè)內(nèi)專家建立起長(zhǎng)期合作關(guān)系，會(huì)持續(xù)推出不同主題的線上/線下產(chǎn)業(yè)學(xué)術(shù)論壇/課程/城市會(huì)等活動(dòng)，始終致力于助力我國(guó)制劑行業(yè)發(fā)展。具體活動(dòng)信息，請(qǐng)關(guān)注艾偉拓公司公眾號(hào)！

以下為線上論壇部分問題及專家答復(fù)整理，分為遞送系統(tǒng)相關(guān)、保護(hù)劑相關(guān)及凍干工藝相關(guān)三部分：

一、脂質(zhì)遞送系統(tǒng)相關(guān)問題及答復(fù)：

1、載有mRNA的LNP的物理穩(wěn)定性如何？已上市疫苗是否也有這方面的問題才選用冷凍儲(chǔ)存方式？

通過檢測(cè)內(nèi)容物滲漏等指標(biāo)，LNP物理穩(wěn)定性整體上是比較穩(wěn)定的。已上市疫苗選擇冷凍儲(chǔ)存的主要原因不是物理穩(wěn)定性問題。

2、魚精蛋白法可以用于沉淀此類脂質(zhì)載體嗎？

理論上或許可行，但做質(zhì)控或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要考慮效率及沉淀比例問題，比如說做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，是否能接近100%沉淀？這個(gè)是一個(gè)需要重點(diǎn)考慮的問題。占昌友老師介紹的抗體法對(duì)于脂質(zhì)載體的沉淀率可以達(dá)到99%以上。魚精蛋白是否可以用于沉淀脂質(zhì)載體，需要根據(jù)沉淀效率等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷。

3、如何解決PEG多次注射產(chǎn)生抗體的問題？

這個(gè)是非常好的問題，是疫苗臨床產(chǎn)生副作用的潛在原因之一。

解決思路有幾點(diǎn)，一個(gè)是將PEG的結(jié)構(gòu)與臨床產(chǎn)生的免疫反應(yīng)進(jìn)行匹配（以進(jìn)一步明確二者因果關(guān)系及作用機(jī)理），一個(gè)是拉長(zhǎng)兩次注射的間隔，比如至少相隔3周以上。

需要明確的一點(diǎn)是，對(duì)PEG進(jìn)行改造，即使可能會(huì)有所改善，但多多少少還是會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定影響。

4、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)LNP怎么儲(chǔ)存？

用于專門研究溫度穩(wěn)定性的LNP，會(huì)儲(chǔ)存于不同溫度條件下（從冷凍到室溫的溫度梯度）。

單純保存用于后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等目的的LNP，儲(chǔ)存于-80℃或者-20℃冰箱。

5、單純研究脂質(zhì)遞送系統(tǒng)載體性能，從成本考慮，可以推薦模型藥物嗎？

對(duì)于脂質(zhì)體，推薦使用阿霉素作為模型藥物。

對(duì)于LNP，熒光蛋白或者Luc是比較常用的，方便檢測(cè)，前者適合細(xì)胞層面的檢測(cè)，如流式，缺點(diǎn)是活體成像容易受到熒光穿透性能限制，后者活體成像普遍，但是流式?jīng)]法檢測(cè)。最終還是要測(cè)定目標(biāo)蛋白表達(dá)量，不同的mRNA體內(nèi)性能一般也不一樣。此外，還可以利用DNA的barcode做篩選，這方面可以查文獻(xiàn)了解一下詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。

6、mRNA拖尾影響翻譯效率，這個(gè)是加合作用造成的，原理是怎樣的？

加合作用指的是LNP中的可電離脂質(zhì)發(fā)生氧化，產(chǎn)生醛基，醛基與mRNA堿基反應(yīng)發(fā)生加合作用，表現(xiàn)為拖尾，該反應(yīng)會(huì)影響mRNA分子的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性，進(jìn)而影響其翻譯效率。（具體原理詳見艾偉拓公眾號(hào)近期推文，會(huì)進(jìn)行詳細(xì)解釋。）

7、siRNA或mRNA的裝載策略可否多闡述一下？主動(dòng)載藥的動(dòng)力和包封率如何？

首先，核酸藥物的載藥不是通過傳統(tǒng)的脂質(zhì)體主動(dòng)載藥方式（如伊立替康脂質(zhì)體使用蔗糖八硫酸酯鉀主動(dòng)載藥或阿霉素脂質(zhì)體使用硫酸銨主動(dòng)載藥），核酸藥物通常是通過微流控體系內(nèi)流體混合的方式來包封的，油相一般是乙醇溶解的各種脂質(zhì)，水相是mRNA水溶液，二者通過微流控快速混合實(shí)現(xiàn)載藥。

包封效率方面，mRNA可以達(dá)到80%~90%，siRNA略低一些，核心問題在于儲(chǔ)存過程中siRNA由于其相對(duì)較小的分子量，泄漏的情況可能會(huì)比mRNA更嚴(yán)重一些。相比之下，siRNA藥物需要在提升包封率與降低儲(chǔ)存期滲漏率方面投入更多考量。

二、保護(hù)劑相關(guān)問題及答復(fù)：

1、脂質(zhì)遞送產(chǎn)品中，糖是如何加入的？工藝是什么樣子的？

根據(jù)部分已上市脂質(zhì)體及LNP藥物的工藝信息，糖類一般是作為透析液在置換外水相時(shí)加入的，通常發(fā)生在超濾步驟，部分液體劑型的脂質(zhì)體，在載藥濃縮后也會(huì)使用含有糖類保護(hù)劑的溶液進(jìn)行定容。

2、海藻糖加入多少量能夠得到較好的LNPs凍干產(chǎn)品？

一般而言，海藻糖的推薦用量低于蔗糖，而蔗糖在脂質(zhì)體產(chǎn)品中，考慮對(duì)粒徑及PDI的控制，推薦用量為12%~20%左右，使用海藻糖可以從低于該范圍的用量開始嘗試，如5%~10%，具體用量需要根據(jù)制劑處方開發(fā)過程中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)決定。

3、凍干工藝參數(shù)對(duì)脂質(zhì)體的保護(hù)起的作用多大？還是只是保護(hù)劑種類更重要？另外，已上市的凍干劑型儲(chǔ)存條件是室溫么？還是必須還是要2-8度？

凍干工藝參數(shù)直接影響的是凍干過程和凍干效果，如一次干燥時(shí)間，最終凍干成品含水量等。如果凍干工藝參數(shù)設(shè)置不合理，一方面會(huì)降低凍干效率增加凍干成本，一方面會(huì)降低凍干成品質(zhì)量。保護(hù)劑種類也是同理，選擇更適宜的凍干保護(hù)劑對(duì)于提升凍干效率及凍干成品質(zhì)量均能夠發(fā)揮作用。二者在開發(fā)凍干劑型脂質(zhì)體制劑中均需納入考量。

已上市凍干劑型脂質(zhì)體藥物有室溫存儲(chǔ)的案例也有冷藏存儲(chǔ)的案例。

三、凍干工藝相關(guān)問題及答復(fù)：

1、請(qǐng)問凍干過程中，cake上升和塌陷的原因分別是什么？

蛋糕上升通常容易發(fā)生在溶質(zhì)含量少的凍干樣品中，或者凍干機(jī)壓力波動(dòng)太大，也容易導(dǎo)致蛋糕上升；講座中康老師提到的情況，是預(yù)凍沒凍住，出現(xiàn)的概率還是比較低的。

塌陷的原因是產(chǎn)品溫度超過了關(guān)鍵溫度。

2、怎么判斷脂質(zhì)體凍干過程中預(yù)凍過程是成功的？

共晶點(diǎn)探頭插入樣品，電阻值達(dá)到最大，可以判斷為已經(jīng)完成預(yù)凍。

3、在LNP-mRNA凍干過程中有什么特別要注意的？LNP-mRNA凍干與化藥脂質(zhì)體干燥有什么異同？

由于LNP-mRNA的凍干項(xiàng)目目前做的還很少，所以還不能總結(jié)一個(gè)準(zhǔn)確的異同點(diǎn)。目前的經(jīng)驗(yàn)是，預(yù)凍溫度需要更低，一次干燥階段壓力需要更低；

4、在小試凍干工藝開發(fā)成功后，再放大到中式凍干機(jī)以及大規(guī)模的過程中，哪些工藝參數(shù)需要改變，哪些工藝參數(shù)不需要改變？在放大的過程中需要注意什么？

一次干燥時(shí)間是一定要重新判斷的。如果研發(fā)階段工藝摸索的足夠充分的話，只需要改變一次干燥時(shí)間，不應(yīng)該在放大的過程中，再重新摸索和調(diào)整板層溫度、腔體壓力，這兩個(gè)參數(shù)應(yīng)該在研發(fā)過程中就已經(jīng)充分研究。

5、如何監(jiān)測(cè)產(chǎn)品在凍干過程中的溫度變化？板層溫度和樣品的實(shí)際溫度是否是一致的？相差多少？

使用產(chǎn)品溫度探頭實(shí)時(shí)在凍干過程中檢測(cè)樣品溫度，建議選擇熱電偶探頭。

板層溫度和樣品溫度在預(yù)凍和二次干燥階段有一致的時(shí)間，一次干燥階段這兩個(gè)溫度都是不同的，溫差為升華熱量來源，至于兩個(gè)溫度差多少，不同產(chǎn)品，不同工藝，差的數(shù)值都不同。

6、在一次干燥中為什么要變化腔體壓力？整個(gè)過程中如何是極限真空會(huì)有什么影響呢？

一次干燥過程中，不需要變化腔體壓力。如果一次干燥階段一直是極限真空，則凍干時(shí)間會(huì)比較長(zhǎng)，效率比較低，而且極限壓力很難控住，這樣的工藝穩(wěn)定性是不足的。

7、在LNP-mRNA凍干時(shí)，怎么判斷預(yù)凍是否成功？在一次干燥，也需要用熱電偶溫度探頭檢測(cè)其溫度嗎？還有凍干機(jī)自帶的溫度探頭一般放置西林瓶的什么位置，距離瓶底多少mm?

預(yù)凍是否成功，用共晶點(diǎn)探頭判斷，共晶點(diǎn)探頭插入樣品，電阻值達(dá)到最大，可以判斷為已經(jīng)完成預(yù)凍。通常用戶用熱電偶溫度探頭檢測(cè)產(chǎn)品溫度，如果有升華界面溫度軟件會(huì)更準(zhǔn)，但因?yàn)檫@個(gè)軟件比較貴，配了這個(gè)功能的用戶比較少。

溫度探頭頂部放在西林瓶靠近底部又沒有接觸底部的位置。

8、凍干時(shí)，溶液的體積占瓶子的體積最多多少？

一般來說，溶液體積通常不超過瓶子體積的一半。但也有客戶幾乎裝滿的，對(duì)于這個(gè)并沒有法規(guī)方面的規(guī)定，只不過裝的越高，工藝時(shí)間越長(zhǎng)，塌陷的風(fēng)險(xiǎn)越高，工藝越難做。因此具體裝入多少溶液進(jìn)行凍干，需要結(jié)合自身設(shè)備、工藝及制劑需求進(jìn)行考量。